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游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒說明書

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游離脂肪酸（FFA）含量試劑盒（測(cè)血清、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞）
微量法 100 管/96 樣
正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異的樣本做預(yù)測(cè)定
測(cè)定意義：
游離脂肪酸，也稱為非酯化脂肪酸，在與白蛋白結(jié)合的血漿中循環(huán)。動(dòng)物血液中的游離脂肪
酸 (FFA )含量是一項(xiàng)重要的生理生化指標(biāo)。血清中游離脂肪酸的濃度與脂類代謝、糖代謝、
內(nèi)分泌功能有關(guān)，游離脂肪酸的濃度會(huì)因?yàn)樘悄虿　⒅匕Y肝障礙、功能亢進(jìn)等疾病而
上升。
測(cè)定原理：
用有機(jī)溶劑萃取 FFA。含有 FFA 的有機(jī)液與三乙醇胺銅反應(yīng),在有機(jī)相中形成脂肪酸銅 (銅
皂) FFA 一 Cu。Cu 離子與顯色液反應(yīng)形成紫紅色絡(luò)合物。反應(yīng)形成的顏色深淺與 Cu 離子
濃度的關(guān)系符合朗伯一比爾定律，因此可利用此反應(yīng)進(jìn)行比色。
自備的儀器和用品：
酶標(biāo)儀、離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、蒸餾水。
試劑的組成和配制：
萃取液：液體 120 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 15 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1 瓶，室溫保存；
試劑四：液體 12 mL×1 瓶，4℃保存；
樣本前處理：
1.動(dòng)物組織：按照動(dòng)物組織質(zhì)量（g）：萃取液 mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組
織，加入 1mL 萃取液），進(jìn)行冰浴勻漿。震蕩提取 15min，5000 rpm 4℃離心 5min，取有
機(jī)相待測(cè)。
2.血清：吸取 50 μL 血清樣本，加入 1 mL 萃取液，震蕩提取 15 min 后，4℃，5000 rpm 離
心 5 min，取有機(jī)相待測(cè)。
3.微生物、細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：萃取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建
議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1 mL 萃取液）加入萃取液，冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 2
秒，間隔 3 秒，總時(shí)間 3min）；震蕩提取 15 min，然后 5000 rpm 4℃離心 5min，取有機(jī)相
待測(cè)。
注意：有機(jī)相待測(cè)液可能存在于上層，也可能存在于下層，注意觀察，體積較多的那一層
即為有機(jī)相待測(cè)液。
測(cè)定步驟：
1、 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 550 nm。
2、 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑一（V）：試劑二（V）：試劑三（m）=1（mL）：
1（mL）：0.66（g）的比例充分混勻。（注意：現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少，在空瓶中配
制，試劑盒中帶有 4 個(gè)空瓶，先將試劑一與試劑二混合，后再加入試劑三粉劑）
3、測(cè)定管：吸取600μL樣本，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離
心5 min，分層后取200μL上層有機(jī)相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測(cè)定550 nm的
吸光值，記為A測(cè)定。
4、空白管：吸取600μL萃取液，加入200μL工作液，蓋緊后震蕩20 min，4℃，5000 rpm離心5 min，分層后取200μL上層有機(jī)相，加入100μL試劑四，搖勻，10 min后測(cè)定550 nm的
吸光值，記為A空白。
空白管只需測(cè)一次?！?/span>A=A測(cè)定-A空白
注意：1、有機(jī)溶劑易揮發(fā)，加入96孔板后應(yīng)盡快檢測(cè)。
2、測(cè)定管中加入的樣本即樣本前處理中的有機(jī)相待測(cè)液。
FFA 含量計(jì)算：
標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.0161x - 0.0141 R2 = 0.9985 x：棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL）
y：吸光值差值△A
1、血清 FFA 含量計(jì)算：
FFA 含量(μmol/mL)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V3×V1÷V2)÷1000
=1.242×(△A+0.0141)
2、動(dòng)物組織、微生物、細(xì)胞中 FFA 含量計(jì)算：
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
FFA 含量(μmol/g 鮮重)=(△A+0.0141)÷0.0161×V1÷（W×V1÷V2）÷1000
=0.062×(△A+0.0141)÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
FFA 含量(μmo/mg prot)= (△A+0.0141)÷0.0161×V1÷(V1×Cpr)÷1000
=0.062×(△A+0.0141)÷Cpr
V1：加入樣本體積，0.6mL；V2：萃取液體積，1mL；V3：加入血清（漿）體積，0.05 mL；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：動(dòng)物組織樣品質(zhì)量，g； 1000：1 μmol=1000 nmol 。
注意事項(xiàng)：
1.蛋白含量不可直接用萃取液提取的有機(jī)相待測(cè)液直接測(cè)定，可用蒸餾水或緩沖液或生理
鹽水選用本公司的 BCA 法蛋白含量測(cè)定試劑盒。
2.zui低檢出限為 20 nmol/mL

 
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